Uso de maquinaria sintética para mejorar el rendimiento de carbono con acetilfosfato como núcleo

Nature Communications volumen 14, número de artículo: 5286 (2023) Citar este artículo

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En las fábricas de células microbianas, la liberación de CO2 durante la producción de acetil-CoA a partir de piruvato disminuye significativamente la economía de los átomos de carbono. Aquí, construimos y optimizamos una vía sintética de conservación de carbono denominada ciclo de sedoheptulosa-1,7-bisfosfatasa con fosfocetolasa trifuncional (SCTPK) en Escherichia coli. Este ciclo se basa en una fosfocetolasa generalista Xfspk y convierte la glucosa en cantidades estequiométricas de acetilfosfato (AcP). Además, se crean circuitos genéticos que responden positiva o negativamente a AcP. Junto con SCTPK, constituyen un oscilador genético-metabólico que regula Xfspk y las enzimas que convierten AcP en sustancias químicas valiosas en respuesta al nivel intracelular de AcP de forma autónoma, asignando el flujo metabólico de manera racional y mejorando la economía de átomos de carbono del proceso de bioconversión. Usando esta maquinaria sintética, se produce mevalonato con un rendimiento superior a su rendimiento teórico nativo, y se logra el título y el rendimiento más altos de 3-hidroxipropionato a través de la vía del malonil-CoA. Este estudio proporciona una estrategia para mejorar la producción de carbono de las fábricas de células microbianas.

Recientemente, la bioproducción de productos químicos y materiales deseados está cobrando impulso debido a su respeto al medio ambiente y su viabilidad práctica. En los procesos de diseño y construcción de fábricas de células microbianas, una cuestión clave es mejorar los flujos hacia el producto de interés y maximizar la economía del átomo de carbono1. Esto es muy importante, especialmente en el marco del logro global del pico de carbono y la neutralidad de carbono. El núcleo de cualquier red metabólica en un microorganismo es una columna vertebral de alto flujo, generalmente denominada metabolismo central2, responsable de la transformación de los sustratos primarios de entrada en energía y una serie de componentes básicos para la producción de polímeros celulares y considerado como el elemento invariable. sistema operativo del celular3. Por lo tanto, si queremos construir una maquinaria sintética que convierta un organismo vivo en una biofábrica verdaderamente productiva, además de optimizar la vía biosintética como unidad independiente, un enfoque de bioingeniería exitoso también debe modificar la red metabólica endógena del huésped, especialmente su metabolismo central. , para apoyar el proceso de bioproducción4. En los microorganismos, la acetil coenzima A (acetil-CoA) no sólo es un metabolito fundamental en las vías metabólicas centrales, sino también un precursor de numerosos productos industrialmente relevantes5,6,7. Por lo tanto, reescribir el metabolismo central del microorganismo para suministrar abundante acetil-CoA con una alta economía de átomos de carbono beneficiará la bioproducción de una amplia variedad de productos químicos y materiales.

Para mejorar el rendimiento de acetil-CoA, una estrategia típica es la eliminación del flujo de carbono a vías competitivas y la sobreexpresión de una enzima importante para garantizar una producción suficiente de acetil-CoA8,9. Este enfoque tiene un diseño más directo y simple, pero en realidad no aumenta el rendimiento teórico de carbono del producto químico objetivo. Los microorganismos naturales suelen convertir la glucosa en acetil-CoA a través de la vía de la glucólisis junto con la descarboxilación del piruvato por la piruvato deshidrogenasa, en la que a partir de cada mol de glucosa se generan 2 moles de acetil-CoA y 2 moles de CO210. Esta liberación de CO2 provoca una disminución significativa de la economía atómica de la ruta biosintética química específica, lo que representa la principal pérdida de carbono en el metabolismo microbiano del carbono y la biorrefinación11. Para resolver este problema, se desarrolló una ruta sintética de glucólisis no oxidativa (NOG) (Figura 1 complementaria), que convierte la glucosa en cantidades estequiométricas de acetilfosfato (AcP), que es catalizada aún más por la fosfato acetiltransferasa a acetil-CoA12. Esta configuración de NOG se basa en el reordenamiento del carbono y la fosfocetolasa que cataliza la conversión irreversible de fructosa-6-fosfato (F6P) o xilulosa-5-fosfato (X5P) en AcP y eritrosa-4-fosfato (E4P) o gliceraldehído-3-fosfato ( BRECHA), respectivamente.

Recientemente, basándose en modelos matemáticos, Andersen et al. propusieron una nueva variante de la vía NOG con la introducción de una nueva actividad fosfocetolasa hacia la sedoheptulosa-7-fosfato (S7P)13. Posteriormente, Hellgren et al. construyeron la variante NOG propuesta en Saccharomyces cerevisiae14. La fosfocetolasa de Bifidobacterium longum, que demostró actuar sobre S7P, F6P y X5P (Xfspk), junto con una sedoheptulosa-1,7-bisfosfatasa endógena (SBPasa), se sobreexpresaron para formar una sedoheptulosa-1,7-bisfosfato (SBP). ) -vía del ciclo dependiente (Fig. 1 y Fig. 1 complementaria). De manera similar a la vía NOG, esta ruta convierte cada mol de glucosa en 3 moles de AcP con un consumo de 1 mol de ATP, y no hay producción ni consumo neto de poder reductor (Datos complementarios 1). Por otro lado, el ciclo dependiente de SBP es la vía de conservación de carbono más corta y requiere solo 6 enzimas, mientras que en NOG 8 enzimas. Ya no requiere transaldolasa y transcetolasa para el reordenamiento del carbono como vía NOG, lo que reduce la cantidad de enzimas involucradas y la complejidad de esta vía, que representa la economía de los átomos de carbono así como la economía de las proteínas. Sin embargo, ese estudio fue solo una prueba de concepto y las cepas de levadura diseñadas que llevaban el ciclo dependiente de SBP todavía presentaban un bajo rendimiento de sustancias químicas derivadas de acetil-CoA a partir de la glucosa14. Además de S. cerevisiae, Escherichia coli también es un microorganismo huésped de elección para la bioproducción. En este estudio, este ciclo dependiente de SBP lleva el nombre de su intermedio y enzima característicos como ciclo SBP con fosfocetolasa trifuncional (SCTPK), y se evaluará y optimizará en E. coli.

a Disminución de las emisiones de CO2 mediante la construcción y optimización de una vía de conservación de carbono SCTPK. G6P glucosa-6-fosfato, F6P fructosa-6-fosfato, AcP acetilfosfato, E4P eritrosa-4-fosfato, SBP sedoheptulosa-1,7-bisfosfato, GAP gliceraldehído-3-fosfato, PfkA 6-fosfofructocinasa I, GapB eritrosa-4 -fosfato deshidrogenasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa GapA. b Desarrollo de un oscilador metabólico genético centrado en AcP, que consta de un módulo de activación y un módulo de represión para reasignar dinámicamente el flujo. c Aplicaciones de la maquinaria sintética en la biosíntesis de sustancias químicas y materiales. Los productos para prueba de concepto incluyen 3-hidroxipropionato, mevalonato y polihidroxibutirato.

La salida de SCTPK es AcP, que no solo es un nodo regulador clave para el metabolismo central, sino también una señal global que afecta diversos procesos celulares a través de la modificación postraduccional de proteínas15. AcP puede donar su grupo fosforilo y activar reguladores de respuesta de sistemas de transducción de señales de dos componentes16,17, y también puede acetilar residuos de lisina para modular la estructura, la actividad enzimática y la estabilidad de la proteína correspondiente18,19. Para evitar posibles efectos desfavorables causados ​​por la acumulación de AcP, es esencial desarrollar un circuito genético que responda a AcP para ajustar el nivel de expresión de genes relacionados en la producción y utilización de AcP de manera sofisticada en una cepa diseñada que porta SCTPK. El sistema Ntr, que consta del sensor NRII (producto glnL) y el regulador de respuesta NRI (producto glnG), controla una respuesta transcripcional a la falta de nitrógeno20. Cuando NRII está ausente, el propio NRI puede detectar el nivel de AcP y activar el promotor glnAp2 en consecuencia21. Como el sistema Ntr desempeña un papel insignificante en la mayoría de las condiciones del biorreactor, se eliminó el NRII y se reclutó al NRI como controlador dinámico para activar la expresión de genes biosintéticos de licopeno en respuesta al indicador de flujo glucolítico AcP en una cepa de E. coli modificada, lo que resultó en mejora de la producción de licopeno21. Este fue el primer ejemplo de control dinámico basado en la detección de un determinado metabolito. Además, se diseñaron osciladores centrados en AcP con la introducción de un represor LacI inducido por AcP que bloquearía la expresión de NRI del promotor glnAp222 o Pta que convierte acetil-CoA en AcP23. Por lo tanto, los circuitos genéticos basados ​​en NRI con propiedades apropiadas son capaces de controlar la expresión de genes relacionados en respuesta al nivel de AcP y ayudarán a mantener la homeostasis intracelular de AcP. Además, el control dinámico del flujo metabólico basado en biosensores que responden a ciertos metabolitos se ha mostrado prometedor no sólo para la asignación racional de recursos intracelulares, sino también para mejorar el rendimiento y el título del producto objetivo, y evitar la carga metabólica y la acumulación tóxica24.

En este estudio, construimos una maquinaria sintética para mejorar el rendimiento de carbono con AcP como núcleo, utilizando E. coli como huésped (Fig. 1). En primer lugar, SCTPK se ensambla mediante la sobreexpresión de Xfspk y SBPase, y se mejora al reprimir la expresión de enzimas competitivas mediante interferencia de ARN antisentido (asRNA). En segundo lugar, se desarrollan una serie de circuitos genéticos activados o reprimidos por AcP, producto de SCTPK, formando un oscilador genético-metabólico que responde al nivel intracelular de AcP. En tercer lugar, la maquinaria sintética aumenta la producción y el rendimiento de algunos productos industrialmente relevantes, incluidos el 3-hidroxipropionato (3HP), el polihidroxibutirato (PHB) y el mevalonato (MVA), cuando se cultivan con glucosa.

SCTPK emplea seis enzimas y todas las enzimas, excepto Xfspk y SBPase, ya están presentes en E. coli (Fig. 2a). Para la SBPasa, se caracterizó que Shb17 de S. cerevisiae catalizara la desfosforilación específica de SBP25, y se informó que algunas fructosa-1,6-bifosfatasas (FBPasas) con dominios de unión a litio altamente conservados tienen actividad promiscua como SBPasa26,27. Por lo tanto, los genes que codifican Shb17 y FBPasas con esta característica de diversas bacterias (Fig. 2 complementaria) se sintetizaron y expresaron en la cepa BL21 (DE3) de E. coli, y se purificaron las proteínas correspondientes fusionadas con una etiqueta His6 (Fig. 3 complementaria). . Además, también se purificó FbaA marcada con His6 de E. coli, FBP aldolasa que cataliza la condensación de E4P y dihidroxiacetona fosfato (DHAP)28, para proporcionar la SBP no disponible comercialmente para el ensayo de actividad in vitro de SBPasa y Xfspk. Como se muestra en la Fig. 2b, GlpX de Synechocystis sp. PCC6803 (SyGlpX) presentó la actividad SBPasa más alta, probablemente porque la actividad SBPasa es necesaria para el ciclo de Calvin-Benson para la fijación de CO2 en cianobacterias29. Cuando también se tuvieron en cuenta los resultados del ensayo de FBPasa (Figura 4 complementaria), se seleccionó SyGlpX ya que se requerían actividades tanto de SBPasa como de FBPasa para la construcción de SCTPK: la SBPasa proporciona la segunda fuerza impulsora irreversible de este ciclo, y la FBPasa disminuye la actividad glucolítica. flujo y empuja el flujo de carbono hacia el SCTPK. Se empleó Xfspk de B. longum para producir AcP a partir de la reacción de escisión aldólica de S7P, F6P y X5P, y esta proteína también se purificó y validó mediante un ensayo de actividad in vitro (Fig. 2c). Como la actividad de Xfspk era menor que la de la SBPasa, el gen xfspk será transportado por un plásmido con alto número de copias para aumentar su nivel de expresión, y el gen glpX de Synechocystis sp. PCC6803 se integrará en el genoma de E. coli bajo el control de un promotor constitutivo fuerte Pj23119 (Figura complementaria 5) en la siguiente construcción de cepa.

a Configuración del SCTPK construido inicialmente. Se sobreexpresaron fosfocetolasa y sedoheptulosa-1,7-bisfosfatasa (SBPasa), y se eliminaron los genes tktAB, talAB, pflB, ldhA, adhE, poxB y aceE. G6P glucosa-6-fosfato, F6P fructosa-6-fosfato, FBP fructosa-1,6-bifosfato, E4P eritrosa-4-fosfato, DHAP dihidroxiacetona fosfato, S7P sedoheptulosa-7-fosfato, R5P ribosa-5-fosfato, Ru5P ribulosa -5-fosfas, X5P xilulosa-5-fosfato, GAP gliceraldehído-3-fosfato, BPG 1,3-bifosfoglicerato, PYR piruvato, AcCoA acetil-CoA, AcP acetilfosfato. b Actividad SBPasa in vitro de proteínas GlpX de Bacillus metanolicus, Saccharomyces cerevisiae CEN.PK, E. coli BW25113, Serratia marcescens, Synechocystis sp. PCC6803 y Thermosynechococcus elongatus (n = 3 muestras biológicas independientes). c Actividad fosfocetolasa de Xfspk de Bifidobacterium longum con X5P, F6P y S7P como sustrato, respectivamente (n = 3 muestras biológicas independientes). d Validación in vivo de SCTPK basada en la disponibilidad de acetil-CoA. Se utilizó como control la cepa Q3952 (tktAB, talAB, poxB, ldhA, adhE, pflB). La eliminación del gen aceE resultó en una deficiencia de crecimiento, que podría compensarse mediante la adición de acetato exógeno o la introducción de SCTPK (la cepa Q3964 generada por la introducción de Xfspk y GlpX de Synechocystis sp. PCC6803 en Q3952 aceE) (n = 3 muestras biológicas independientes ). e Un SCTPK funcional rescató el crecimiento del mutante gnd de E. coli que es deficiente en la biosíntesis de R5P (n = 3 muestras biológicas independientes). f La densidad celular final y la tasa de crecimiento específica de las cepas de E. coli (n = 3 muestras biológicas independientes). La concentración intracelular de AcP (g) y piruvato (h) de E. coli BW25113, cepa Q3952 ΔaceE y cepa Q3964 (n = 6 muestras biológicas independientes). Barra de error, media ± desviación estándar (DE). Se realizaron pruebas t de Student de dos colas para determinar la significación estadística. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para ensamblar la SCTPK in vivo, se desarrolló como cepa inicial un mutante Q3952 de E. coli BW25113, en el que se eliminaron los genes tktAB y talAB, responsables del reordenamiento del carbono, para excluir la interferencia de la vía NOG, y genes relacionados con subproductos. Se eliminaron acetato, lactato, etanol y formiato (poxB, ldhA, adhE, pflB) para eliminar la pérdida de carbono (Fig. 2a). Además, la producción de acetil-CoA a partir de la descarboxilación del piruvato se bloqueó mediante la eliminación del gen aceE, lo que resultó en una deficiencia de crecimiento tanto en el medio M9 modificado que contenía 1 g/l de extracto de levadura como en el medio LB, lo que podría compensarse mediante la adición de acetato de potasio exógeno (Fig. .2d y figura complementaria 6). Por el contrario, la cepa Q3964 generada por la introducción de Xfspk y SyGlpX en Q3952 ΔaceE se recuperó de la incapacidad de crecimiento (Fig. 2d, f), lo que demuestra que el SCTPK construido reponía el conjunto de acetil-CoA. Además, se eliminó el gen gnd, lo que debería conducir al agotamiento de la ribosa-5-fosfato (R5P), el precursor de la síntesis de nucleótidos y histidina, en una cepa deficiente en la reordenación del carbono. Sin embargo, el mutante gnd creció tan bien como su cepa original, lo que indica que R5P podría generarse como un intermediario de SCTPK, lo que se confirma por el hecho de que un mutante gnd con SCTPK incompleto no podría crecer incluso con la presencia de acetato de potasio ( Figura 2e, f). Todos estos resultados demostraron que SCTPK funciona bien in vivo y puede generar acetil-CoA de una manera que evita el proceso de liberación de carbono del piruvato a acetil-CoA.

Posteriormente se probó el contenido de metabolitos en la cepa que integra SCTPK y mostró que la concentración de AcP es 1,79 veces mayor que la de la cepa de tipo salvaje (Fig. 2g), lo que indica que nuestra estrategia de ingeniería aumenta la producción de AcP. En la cepa Q3952 aceE, la concentración de piruvato intracelular fue 2,34 veces mayor que la de la cepa de tipo salvaje, y disminuyó significativamente por la sobreexpresión de Xfspk y SyGlpX, pero permaneció más alta que la cepa salvaje (Fig. 2h). lo que sugiere que se requiere una mayor optimización para atraer el flujo de carbono hacia el SCTPK y aumentar el rendimiento de carbono.

En la cepa con SCTPK, se observó que algunas enzimas pueden desviar esta vía y, por lo tanto, causar pérdida de carbono (Fig. 3a). Entre ellos, PfkA cataliza las reacciones de F6P a FBP y de S7P a SBP, las cuales son reacciones inversas de SBPasa; GapA permite la producción de glicerato-1,3-bisfosfato (BPG), que ingresa a la glucólisis para producir piruvato; GapB convierte E4P en 4-fosfo-d-eritronato (4PE), un inhibidor de la isomerasa R5P (Rpi)30 involucrada en SCTPK. Por lo tanto, se planeó anular la expresión de estos genes mediante la interferencia de asRNA.

a Genes que pueden desviar la SCTPK y serán reprimidos mediante interferencia de ARN antisentido (asRNA). b La eficacia de inhibición del ARNas con extremos emparejados se vio afectada por la longitud y el nivel de transcripción del ARNas. Los números a continuación de los promotores representan las fortalezas relativas de los promotores correspondientes, que se determinaron utilizando GFP como indicador y se muestran en la figura complementaria 5. c La concentración intracelular de AcP de E. coli BW25113, Q3964 que alberga SCTPK y tres cepas derivadas de Q3964 en el que la transcripción de gapA, gapB y pfkA se reprimió fuertemente utilizando un ARNas de 100 nt transcrito de un promotor Pj23119, respectivamente (n = 3 muestras biológicas independientes). d La densidad celular final y la tasa de crecimiento específica de las cepas de E. coli (n = 3 muestras biológicas independientes). e Nivel relativo de ARNm de gapA, gapB y pfkA en cepas con y sin asRNA correspondiente determinado por qRT-PCR (n = 3 muestras biológicas independientes con dos repeticiones técnicas). f Efecto de la represión combinacional y jerárquica de gapA, gapB y pfkA en el nivel intracelular de AcP (n = 3 muestras biológicas independientes). g La densidad celular final y la tasa de crecimiento específica de las cepas de E. coli (n = 3 muestras biológicas independientes). h Tasa de emisión de CO2 de las cepas de E. coli BW25113 y Q4531 que portan SCTPK optimizado (n = 2 muestras biológicas independientes). i Emisión relativa de CO2 de BW25113 y Q4531 (n = 2 muestras biológicas independientes). j La concentración de piruvato intracelular de E. coli BW25113, Q3964 y Q4531 (n = 6 muestras biológicas independientes). k Acumulación de acetato en cultivos de E. coli BW25113 y Q4531 (n = 3 muestras biológicas independientes). Barra de error, media ± DE. Se realizaron pruebas t de Student de dos colas para determinar la significación estadística. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Como se informó anteriormente31, una estructura de tallo de doble cadena, que se crea con repeticiones invertidas que flanquean el ARNas, podría estabilizar la estructura secundaria del ARNas y mejorar la eficiencia y duración del silenciamiento génico (Figura 7a complementaria), y nuestros resultados ilustraron posteriormente que el ARNas la longitud y el nivel de transcripción, que se ve afectado por su promotor y el número de copias del gen, determinaron sinérgicamente la eficiencia del silenciamiento del ARNas (Fig. 3b y Fig. 7 complementaria). Luego, los genes diana pfkA, gapA y gapB se inhibieron individualmente con ARNas de 100 nt transcrito por el promotor fuerte Pj23119, y se detectó el contenido de AcP. Como se muestra en la Fig. 3c, cuando se suprimió la expresión del gen pfkA, la concentración de AcP fue 2,23 veces y 1,24 veces mayor que la cepa de tipo salvaje y Q3964, respectivamente. Sin embargo, los ARNas de alto nivel dirigidos a gapA y gapB disminuyeron drásticamente el contenido de AcP, así como la densidad celular final y la tasa de crecimiento específica (Fig. 3c, d). En cepas con ARNas correspondientes, la transcripción de gapA, gapB y pkfA se redujo al 4,9%, 6,7% y 27,2% de la de la cepa de control que tenía solo tallo de doble hebra pero no secuencia de ARNas (Fig. 3e). Estos resultados indicaron que una fuerte represión de la expresión de gapA y gapB perjudicó gravemente el crecimiento celular probablemente debido a su papel insustituible en la glucólisis y la síntesis de vitamina B6 (Figura complementaria 8).

A continuación, se construyeron cepas reguladas de forma combinada con pfkA altamente inhibida y represión moderada o débil de gapB (ARNas de 80 nt con promotor Pj23119 o Pj23118 respectivamente) (Figuras complementarias 9 y 10), y la detección fenotípica mostró que la represión débil del gen gapB aumentó La concentración intracelular de AcP fue 2,45 veces mayor que la de la cepa de tipo salvaje, aunque la densidad celular final y la tasa de crecimiento disminuyeron ligeramente (Fig. 3f, g). Luego, se introdujeron módulos que mediaban la represión moderada o débil de gapA, y la represión moderada del gen gapA aumentó la concentración de AcP al nivel más alto, que fue 2,83 veces mayor que el de la cepa de tipo salvaje, y no afectó dramáticamente el crecimiento celular. (Figura 3f, g). Esta cepa con pfkA altamente reprimida, brechaA moderadamente reprimida y brechaB débilmente reprimida fue la mejor entre todas las cepas construidas y fue nombrada Q4531. A modo de comparación, una cepa con los tres genes reprimidos moderadamente presentó un rendimiento un poco más débil tanto en la producción de AcP como en el crecimiento celular, lo que indica que un sistema regulador jerárquico para diferentes genes favorece la mejora del rendimiento de carbono de SCTPK.

Posteriormente, se determinó la liberación de CO2 de las cepas de E. coli BW25113 y Q4531 de tipo salvaje. La tasa de liberación de CO2 experimentó cambios significativos durante el proceso de cultivo, y la cepa Q4531 presentó una tasa máxima de emisión de CO2 de 4,20 ml/h, menos de un tercio de la de la cepa BW25113 (Fig. 3h). La liberación total de CO2 de la cepa Q4531 disminuyó al 47,4% en comparación con E. coli de tipo salvaje (Fig. 3i). Además, la cepa Q4531 mostró una disminución significativa en la concentración de piruvato en relación con la cepa de tipo salvaje y Q3964 (Fig. 3j), lo que sugiere que el flujo metabólico se desplazó más hacia SCTPK después del silenciamiento génico con matrices de ARN as combinacionales. Además, la cepa Q4531 mostró una capacidad de acumulación de acetato que solo representa el 11% de la cepa de tipo salvaje (Fig. 3k). Hasta ahora, las matrices de ARN as combinacionales han mejorado aún más la eficacia de la SCTPK diseñada, han mejorado la producción de AcP y han reprimido la liberación de CO2 y la acumulación de subproductos, lo que ha dado como resultado una mejor economía de átomos de carbono. Además, se confirmó que las secuencias repetidas para formar extremos emparejados de ARNas no alteraban la estabilidad genética de los plásmidos correspondientes (Figura complementaria 10).

Como la proteína NRI puede ser fosfilada directamente por AcP, se empleó aquí para detectar AcP y modular la expresión génica en consecuencia. El NRI fosforilado es capaz de unirse a secuencias potenciadoras aguas arriba del promotor glnAp2, interactuando frecuentemente con la σ54-ARN polimerasa ensamblada en glnAp2 e iniciando la transcripción (Fig. 4a). Además, los sitios de baja afinidad para NRI-P que se ubican entre el potenciador y el promotor glnAp2 constituyen un gobernador, lo que limita la actividad máxima del promotor a altas concentraciones de NRI-P33.

a El mecanismo regulador del sistema de dos componentes Ntr en el promotor glnAp2. El regulador NRI (codificado por glnG) puede ser fosforilado por la quinasa sensora NRII (codificada por glnL) o AcP, unirse a la secuencia potenciadora y activar el promotor glnAp2; sin embargo, un NRI fosforilado excesivo se unirá al gobernador y limitará la actividad máxima del promotor. . b La inserción de un terminador fuerte rrnB T1 eliminó el bucle de avance autoactivado de NRI. Se insertaron genes que codifican proteínas fluorescentes azules y rojas en el cromosoma de E. coli que flanquea el terminador glnA y se observaron las células mediante microscopía confocal láser. Las barras de escala eran de 2 μm. Se obtuvieron resultados similares de tres muestras biológicas independientes y se mostró un resultado representativo. c Modelo que ilustra una puerta AND sintonizable formada por AcP y NRI como entradas y expresión GFP como salida. d Las características estructurales y de respuesta de los circuitos activados por AcP (n = 3 muestras biológicas independientes). El plásmido pRSF es un derivado de pRSFDuet-1, en el que se eliminaron el gen lacI y el promotor T7. e Rango dinámico de los circuitos genéticos activados por AcP (n = 3 muestras biológicas independientes). f Vista de acoplamiento de la región hélice-giro-hélice (HTH) de E. coli NRI unida al potenciador. g Simulación de interacciones de la región HTH de NRI de E. coli con los medios sitios derechos de tres potenciadores P, N e I diseñados artificialmente. Las líneas discontinuas rojas y azules representan enlaces de hidrógeno y fuerza electrostática entre NRI y potenciadores. h Secuencias potenciadoras mutadas del promotor glnAp2. Se utilizaron potenciadores que contenían secuencias palíndromas perfectas (P), casi perfectas (N) e imperfectas (I) para reemplazar las mejoras 1 y 2 originales para generar nueve promotores glnAp2 mutados. i Rango dinámico de circuitos activados por AcP con secuencias potenciadoras mutadas en el promotor glnAp2 (n = 3 muestras biológicas independientes). "Orig" representa la secuencia potenciadora original, mientras que el resto se refiere a diferentes combinaciones de secuencias P, N e I en los sitios potenciadores 1 y 2. Barra de error, media ± DE. Se realizaron pruebas t de Student de dos colas para determinar la significación estadística. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para hacer que este promotor AcP sea inducible, se eliminó el gen glnL, lo que obviamente no afectó el crecimiento de E. coli (Figura 11 complementaria). En el cromosoma de E. coli, el operón glnLG se ubica justo aguas abajo del gen glnA, y el terminador glnA (TglnA) no es lo suficientemente efectivo como para detener completamente la transcripción34, lo que resulta en un bucle de avance autoactivado de NRI, lo cual se confirma con nuestro análisis. resultados obtenidos de una cepa que porta genes de proteínas fluorescentes azules y rojas que flanquean TglnA (Fig. 4b). Para evitar que la interferencia del nivel de NRI aumente con el tiempo, se introdujo un terminador fuerte rrnB T1 frente al TglnA nativo, que cerró la expresión de la proteína fluorescente roja y disminuyó el coeficiente de lectura de 0,76 a 0,06 (Fig. 4b y Fig. Suplementaria). . 12), lo que sugiere que se eliminó el circuito de retroalimentación. Estos nos proporcionaron una variedad de plataforma para construir el circuito genético que responde a AcP dependiente de NRI.

A continuación, se construyó el circuito AI basado en puerta AND utilizando AcP y NRI como entradas duales y proteína fluorescente verde (GFP) como indicador (Fig. 4c), y se determinó la dosis-respuesta de AcP. La intensidad de la fluorescencia mostró una tendencia a aumentar y luego disminuir cuando se elevaba la concentración de AcP (Fig. 4d). Se especuló que este fenómeno no monótono fue causado por la secuencia gobernadora que establece el límite superior de expresión del promotor glnAp2. Por lo tanto, el gobernador fue mutado para generar el circuito AII, que presentó una curva de respuesta creciente monótona (Fig. 4d). Para mejorar la fuerza transcripcional del promotor glnAp2, el gen glnG se sobreexpresó a partir de un plásmido bajo el control del promotor Pj23118 en lugar del locus genómico, lo que dio como resultado una fluorescencia máxima de GFP 3,82 veces mayor que la del circuito genético AII y un rango dinámico de 10,4. -doblar (Fig. 4d, e).

Para mejorar aún más el rango dinámico y obtener una característica de respuesta más rica a AcP, se investigó exhaustivamente la interacción de NRI y el potenciador y la secuencia del potenciador se mutó en consecuencia. Se identificó que un dominio hélice-giro-hélice (HTH) en la región C-terminal de E. coli NRI tiene funciones de reconocimiento potenciador y unión al ADN basándose en los siguientes hechos: este dominio se conserva en NRI de diversas especies (Figura complementaria . 13a), contiene tres residuos conservados (Arg456, Asn457 y Arg461) que desempeñan un papel esencial en la afinidad por el ADN en Salmonella Typhimurium NRI35, y E. coli NRI con un dominio HTH mutado ya no respondió al nivel de AcP (Figura complementaria 13b). ). Posteriormente, se simuló la estructura compleja del ADN y el dominio NRI HTH de E. coli utilizando la estructura binaria del dominio HTH NtrC4 de Aquifex aeolicus y el ADN bicatenario (PDB: 4FTH) como plantilla (Fig. 4f), y el resultado sugirió que un La secuencia de ADN GGTGCA formó el complejo más estable con esos tres residuos de aminoácidos conservados a través de enlaces de hidrógeno y fuerza electrostática (Fig. 4g). Con base en esta estructura, se diseñaron tres secuencias potenciadoras con diferente afinidad por NRI para reemplazar los sitios potenciadores nativos 1 y 2 del promotor glnAp2 en el circuito genético AIII (Fig. 4g, h), lo que resultó en una pequeña biblioteca que contiene nueve promotores glnAp2 mutados. Todos estos biosensores aún mostraban una respuesta a la concentración de AcP, y parecía que la afinidad del potenciador por NRI se correlacionaba positivamente con la fuerza del promotor glnAp2, es decir, la intensidad de fluorescencia a una determinada concentración de AcP, pero se correlacionaba negativamente con el rango dinámico de los biosensores correspondientes ( Figura 4i). En conjunto, se seleccionó el circuito AIIIf con el rango dinámico más alto de 30,3 veces, una expresión de fuga basal baja y una fuerza de expresión aceptable a un nivel alto de AcP (Fig. 4d).

A continuación, se ajustó la expresión de NRI. Cuando el gen glnG se sobreexpresó bajo el control de un promotor más débil Pj23116, el rango dinámico aumentó a 57,1 veces; sin embargo, la señal de salida máxima fue menor que la del circuito AIIIf (Fig. 4d, e). En el caso de que el gen glnG se expresara a partir de su locus genómico original, la señal de salida máxima disminuyó aún más y el rango dinámico fue 27,9 veces (Fig. 4d, e). En conjunto, se obtuvo una serie de circuitos genéticos activados por AcP con diferentes tiempos de conmutación, intensidades reguladoras y rangos dinámicos ajustando las secuencias de acción cis (potenciadores y reguladores) y la expresión NRI del elemento de acción trans del promotor glnAp2.

El circuito genético de respuesta negativa de AcP se construyó basándose en la siguiente idea, es decir, el promotor genómico glnAp2 con secuencia gobernadora mutada se utiliza para modular la expresión de un represor transcripcional PhlF de Pseudomonas fluorescens36, que reprimirá la expresión del gen informador gfp. del protómero PphlF (Fig. 5a). En la cepa que porta una construcción inicial RI, la proteína PhlF se expresó específicamente en respuesta a la adición de AcP (Fig. 5b). Además, se observó la represión de la fluorescencia de GFP dependiente de AcP, y esta represión se vio socavada por la adición de 2,4-desacetilfloroglucinol (DAPG) que puede unirse y liberar la proteína PhlF del promotor PphlF (Fig. 5c), lo que sugiere que la represión fue mediado por el represor PhlF pero no por un efecto directo de AcP. Sin embargo, esta cepa presentó un alto umbral de respuesta de AcP y una expresión cuantitativa con fugas a altas concentraciones de AcP.

a Diseño del circuito de respuesta negativa AcP. El gen represor phlF de Pseudomonas fluorescens fue controlado por el promotor glnAp2, y la proteína PhlF inhibirá la expresión del promotor PphlF. Se mostró la supuesta secuencia de unión a PhlF. El 2,4-desacetilflorogluicnol (DAPG) puede liberar PhlF del promotor PphlF. b Expresión de la proteína PhlF a diferentes concentraciones de AcP. Los lisados ​​​​celulares de la cepa Q4562 que portaban el circuito RI inhibido por AcP cultivados en diversas concentraciones de AcP se separaron mediante SDS-PAGE y se visualizaron mediante tinción con azul de Coomassie e inmunotransferencia anti-His6. Se obtuvieron resultados similares de dos muestras biológicas independientes y se mostró un resultado representativo. c Validación del circuito inhibido por AcP dependiente de PhlF (n = 3 muestras biológicas independientes). La represión fue socavada por la mutación de la secuencia phlO y la adición de DAPG. d Efecto de operadores phlO adicionales aguas abajo del promotor PphlF en el circuito inhibido por AcP. Se mostraron la fluorescencia de GFP (n = 3 muestras biológicas independientes) y el nivel de ARNm (n = 3 muestras biológicas independientes con dos repeticiones técnicas) con ausencia de proteína PhlF. e Efecto del operador phlO aguas arriba adicional y la oligomerización de PhlF en circuitos inhibidos por AcP (n = 3 muestras biológicas independientes). Se insertó un operador phlO aguas arriba del promotor PphlF con una distancia de los centros de dos secuencias phlO de 63 pb. El dominio C-terminal del represor del fago λ cI y diferentes péptidos conectores se fusionaron con PhlF para mediar en su oligomerización. f Efecto de la distancia entre dos operadores en circuitos inhibidos por AcP (n = 3 muestras biológicas independientes). Se utilizó la proteína PhlF-(PT)4P-cI. La línea de puntos representó la intensidad de la fluorescencia sin operador aguas arriba. g Refinar aún más la influencia de la distancia entre dos operadores (n = 3 muestras biológicas independientes). Se construyeron y probaron circuitos genéticos con una distancia de 48-80 pb a una concentración de AcP de 2,14 mM/OD. h Características de los circuitos inhibidos por AcP con PhlF y operadores diseñados (n = 3 muestras biológicas independientes). Barra de error, media ± DE. Se realizaron pruebas t de Student de dos colas para determinar la significación estadística. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para mejorar esta configuración de represión, se insertó una copia adicional del sitio de unión de PhlF phlO en el promotor de PphlF para fortalecer la afinidad del represor de PhlF por este promotor. Entre las regiones −35 y −10 del promotor PphlF, una secuencia de 24 pb que contenía repeticiones invertidas se consideró como un supuesto operador phlO, y su mutación abolió por completo la represión mediada por PhlF en el promotor PphlF (Fig. 5c). A continuación, se insertaron una y dos copias del operador phlO aguas abajo del sitio de inicio de la transcripción, respectivamente, como se muestra en la Fig. 5d. Sorprendentemente, se observó una disminución gradual en la fluorescencia incluso con la ausencia de la proteína PhlF después de la inserción de phlOs, pero el nivel de ARNm de gfp no cambió significativamente (Fig. 5d). Se creía que este fenómeno era causado por la estructura secundaria de la región 5' no traducida que estaba estabilizada por una secuencia phlO adicional (Figura 14 complementaria) y afectaba el inicio de la traducción de genes posteriores. Luego, se insertó un operador phlO aguas arriba del promotor PphlF con una distancia entre los centros de dos secuencias phlO de 63 pb. Sin embargo, esta inserción tampoco cambió el patrón de expresión de GFP con la presencia y ausencia de la proteína PhlF (RIII en la Fig. 5e y Fig. 15 complementaria).

Para que estos operadores actúen de forma sinérgica, un método es la generación de bucles de ADN mediante una proteína o un complejo de proteínas que se une simultáneamente a dos sitios separados en una molécula de ADN37. Como la proteína PhlF generalmente forma un dímero que se une a dos repeticiones invertidas en un operador phlO y no puede formar complejos de orden superior36, se fusionó con el dominio C-terminal del represor λ cI38 que media una interacción intermolecular que resulta en la unión cooperativa de dos PhlF. dímeros a operadores phlO adyacentes (Fig. 5e). Como esperábamos, la introducción del dominio de oligomerización redujo eficazmente el umbral de respuesta de AcP y la expresión con fugas. Posteriormente, se insertaron varios conectores peptídicos entre los dominios PhlF y cI, respectivamente, para aumentar la separación espacial y evitar la interferencia mutua entre los dominios. Entre ellos, el enlazador (PT) 4 P mostró la mayor ejecución de supresión (Fig. 5e).

A continuación, se ajustó la distancia entre dos operadores phlO para explorar su efecto sobre el bucle de ADN. Como se muestra en la Fig. 5f, la producción de fluorescencia aumentó a medida que el phlOup se alejó gradualmente, y la represión dependiente del bucle de ADN funcionó principalmente en el rango de distancia de 47 a 297 pb. Además, el espaciador se refinó aún más a 48, 50, 52…78, 80 pb, y la señal de salida mostró una fluctuación periódica relacionada con la distancia con un período de 11 pb, que es exactamente el número de pares de bases por vuelta helicoidal de ADN bicatenario (Fig. 5g). Estos resultados sugirieron que la formación de bucles de ADN se ve afectada por la dirección relativa de dos operadores en la molécula de ADN. Específicamente, cuando los dos operadores están desviados posicionalmente o ubicados en lados opuestos, el bucle de ADN será estructuralmente inestable debido a la acción rígida de la hélice del ADN, lo que resultará en una disminución en su rendimiento de represión. Además, se demostró que el empaquetamiento espacial formado entre el promotor pphlOup y PphlF era despreciable y no afecta la transcripción del promotor PphlF siempre que su distancia fuera superior a 7 pb (Figura complementaria 16). Además, se confirmaron las propiedades de respuesta de AcP de tres circuitos genéticos con represor PhlF diseñado y una distancia diferente de dos operadores phlO de 60, 63 y 66 pb, respectivamente (Fig. 5h). Los resultados mostraron que los tres circuitos genéticos presentaron un perfil de represión significativamente mejor que la construcción inicial, y el que tiene un espaciador de 66 pb entre los operadores phlO tiene una respuesta de señal más rápida, una mejor capacidad cooperativa y una menor expresión de fuga que los demás.

Finalmente, la portabilidad de los circuitos genéticos dinámicos activados e inhibidos por AcP se verificó reemplazando la GFP indicadora con β-galactosidasa (β-gal), y se obtuvo el perfil de expresión apropiado de β-gal en condiciones con varias concentraciones intracelulares de AcP ( Figura complementaria 17). En resumen, se construyeron una serie de circuitos genéticos sensibles a AcP con diferentes propiedades que pueden usarse para controlar la expresión de enzimas metabólicas.

Como la expresión dinámica de genes metabólicos es capaz de gestionar mejor las compensaciones entre crecimiento y producción y puede mejorar el rendimiento y el título de los productos objetivo24, los circuitos que responden a AcP se emplearán para controlar la transcripción de genes relacionados con la producción y el consumo de AcP. rutas. En concreto, los circuitos activados por AcP se utilizan para controlar la ruta de consumo de AcP, es decir, la producción de acetil-CoA catalizada por la fosfato acetiltransferasa (Pta), y los circuitos inhibidos por AcP se utilizan para controlar la generación de AcP catalizada por Xfspk en SCTPK. Como consecuencia, el destino bacteriano se dividirá en dos modos de ciclo mutuo (Fig. 6a). La manifestación y alternancia de estos dos destinos estará determinada únicamente por la concentración intracelular de AcP.

a Los estados celulares alternos presentados por los osciladores de respuesta AcP. Este metabolizador consta de una red con grupos de dos metabolitos AcP y acetil-CoA producidos por las enzimas Xfspk y Pta, cuyas expresiones están reguladas negativa y positivamente por AcP, respectivamente. En el Estado A, donde el AcP es bajo, Xfspk se expresa junto con GFP. La acumulación de AcP reprime Xfspk y regula positivamente Pta y mCherry, generando acetil-CoA a partir de AcP. Con la disminución del nivel de AcP y el aumento del nivel de acetil-CoA, Xfspk se expresa nuevamente y Pta se desactiva, regresando al Estado A. b–f Cuantificación de la fluorescencia relativa en el tiempo de cepas de E. coli portadoras de Osciladores IV, respectivamente (n = 6 muestras biológicas independientes). Las estructuras detalladas de estos osciladores se muestran en la figura complementaria 18. g La concentración intracelular de AcP de la cepa Q4602 de E. coli que porta SCTPK y Oscilador III (n = 3 muestras biológicas independientes). h Análisis de inmunotransferencia anti-acetilisina de proteínas de células completas de E. coli BW25113, Q4531 que porta SCTPK y Q4602. Los lisados ​​​​de células completas se separaron mediante SDS-PAGE y se visualizaron mediante tinción con azul de Coomassie e inmunotransferencia anti-acetilisina (anti-AcK). Se obtuvieron resultados similares de dos muestras biológicas independientes y se mostró un resultado representativo. i Nivel relativo de ARNm de xfspk y pta en la cepa Q4602 determinado por qRT-PCR (n = 3 muestras biológicas independientes con dos repeticiones técnicas). j Patrón espacial formado por la cepa Q4602. Las células se esparcieron homogéneamente sobre una placa de agar y se colocó en el centro un disco de papel empapado con 15 µl de AcP 1 M para crear un gradiente radial de AcP. Se utilizó como control una cepa con GFP expresada constitutivamente y mCherry (sección superior). Barra de error, media ± DE. Se realizaron pruebas t de Student de dos colas para determinar la significación estadística. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para implementar este esquema, se utilizó el circuito activador AI construido para controlar la transcripción de los genes pta y mcherry, así como el circuito RI para controlar la expresión de xfspk y gfp, para generar un dispositivo prototipo I (Figura complementaria 18). Como se esperaba, las curvas de expresión de fluorescencia sugirieron que GFP y mCherry exhibieron expresión oscilatoria en fases opuestas. Sin embargo, se observó una amplitud de GFP mayor que la de mCherry y la expresión oscilatoria se volvió borrosa gradualmente después de dos ciclos (Fig. 6b). En el oscilador II, el promotor glnAp2 fue reemplazado por su derivado con una secuencia potenciadora optimizada, lo que resultó en una fuga de expresión reducida de mCherry, pero el comportamiento oscilatorio aún era insostenible (Fig. 6c).

A continuación, en el oscilador III, el activador NRI se expresó a partir de un plásmido bajo el control del promotor Pj23116 en lugar de su locus genómico para aumentar el nivel de NRI, y el controlador disuasorio de la rama de represión se cambió a PhlF-(PT)4P-cI diseñado. y promotor PphlF con operadores dobles phlO para mejorar la eficiencia de la represión. Como consecuencia, se observó un estado oscilatorio sostenido con un ciclo de aproximadamente 12 h, y dos módulos tenían amplitudes similares y fases opuestas, lo que demuestra que este dispositivo tenía una mejor sintonizabilidad de sincronización, mayor robustez y mayor resistencia al ruido (Fig. 6d). ). Un aumento adicional del nivel de NRI mediante el uso de un promotor más fuerte Pj23118 en el oscilador IV aceleró el ritmo oscilatorio, lo que resultó en el cambio de dos modos cada 9 h (Fig. 6e). Sin embargo, hubo un cierto grado de fuga de expresión del gen mCherry en el módulo de activación, y la amplitud de mCherry también fue mayor que la de GFP. Para reducir la expresión de fondo de mCherry, el gen lacI se colocó corriente abajo del promotor PphlF en el módulo de represión para producir el represor LacI que se correlaciona negativamente con el nivel de AcP intracelular que bloqueará el promotor glnAp2 en el módulo de activación. Curiosamente, esto no solo redujo la expresión de mCherry y prolongó el tiempo de cambio en comparación con el Oscilador IV, sino que también condujo a una disminución gradual de la amplitud de mCherry y GFP para generar una oscilación amortiguada (Fig. 6f). Además, se observaron perfiles de color con múltiples gradientes visuales en células de E. coli que portan redes oscilatorias sintéticas (Figura 19 complementaria), lo que indica la efectividad y las diversas características de respuesta de estos circuitos oscilatorios.

Para evaluar directamente el efecto del sistema de oscilación, se determinaron la concentración intracelular de AcP y el nivel transcripcional de los genes pta y xfspk en la cepa Q4602 que porta SCTPK y Oscilador III. Como se muestra en la Fig. 6g, el nivel de AcP fluctuó alrededor de 2 mM/OD, que era mucho más bajo que el de la cepa Q4531 que llevaba SCTPK solo. Además, la disminución de la concentración de AcP también devolvió la acetilación de la proteína a un nivel similar al de la cepa de tipo salvaje (Fig. 6h), evitando posibles efectos reguladores desfavorables causados ​​por la acumulación de AcP. Además, los genes pta y xfspk se transcribieron de forma oscilatoria en fases opuestas, y el nivel de ARNm de pta cambió sincrónicamente con la concentración intracelular de AcP (Fig. 6i).

Además de la oscilación periódica en el tiempo, nuestro oscilador también podría permitir patrones espaciales. Como se muestra en la Fig. 6j, la cepa Q4602 que porta SCTPK y Oscilador III se extendió homogéneamente sobre una placa de agar y se agregó una fuente central de AcP para formar un gradiente radial. Al expresar diferentes proteínas de fluorescencia, la población bacteriana isogénica interpretó el gradiente de AcP en dos zonas de color discretas: rojo y verde, como la bandera de Bangladesh. Por el contrario, una población bacteriana que porta genes gfp y mCherry no regulados solo presentó un amarillo uniforme a pesar del gradiente de AcP.

En general, se construyeron cinco dispositivos oscilantes mediante la integración de la regulación transcripcional y el metabolismo diseñado, que podrían clasificarse en tres categorías: oscilación no sostenida, sostenida y amortiguada. La red oscilatoria construida es capaz de regular la expresión de genes metabólicos de forma precisa, espontánea y en tiempo real para mantener la homeostasis de AcP en células de E. coli.

El objetivo final de construir una red artificial que incluya SCTPK y osciladores es mejorar la economía del átomo de carbono durante la biosíntesis de productos químicos y materiales. En esta red, el SCTPK es la parte de "generación de AcP", que canaliza más átomos de carbono al intermediario metabólico central AcP y aumenta el límite superior teórico de conversión atómica, los genes de la vía biosintética junto con pta componen la sección de "bioproducción" aguas abajo y el oscilador. regula la transcripción de genes relacionados en respuesta al nivel intracelular de AcP (Fig. 7a). Aquí, se adaptaron tres productos, 3HP, PHB y MVA, como sustitutos de la prueba de concepto (Fig. 7b). Para probar si la fábrica de células microbianas equipada con este sistema oscilador posee un mejor rendimiento, también se construyeron dos tipos de cepas en las que los genes biosintéticos están regulados con un modelo de control estático y un interruptor dinámico (Figura complementaria 20).

a Esquema de la red artificial dividida en dos modelos para la biosíntesis de sustancias químicas y materiales. b Vías biosintéticas de 3HP, MVA y PHB utilizando AcP como precursor. Los genes se regularon mediante tres estrategias diferentes, incluido el control estático, el cambio dinámico y la regulación oscilatoria, como se muestra en las figuras complementarias. 21, 23–24. pta, fosfato acetiltransferasa; mvaE, acetil-CoA acetiltransferasa/HMG-CoA reductasa; mvaS, hidroximetilglutaril-CoA sintasa; phaA, acetil-CoA acetiltransferasa; phaB, 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa; phaC, 3-hidroxibutirato polimerasa; accADBC, complejo acetil-CoA carboxilasa; mcr, malonil-CoA reductasa. c Curva de crecimiento de cepas para la producción de 3HP durante el cultivo en matraz con agitación utilizando glucosa como única fuente de carbono (n = 3 muestras biológicas independientes). d El título de 3HP y el rendimiento de cepas con diversas estrategias reguladoras (n = 3 muestras biológicas independientes). La línea discontinua representa el rendimiento teórico nativo de 3HP a partir de glucosa. e Acumulación de acetato y lactato de las cepas Q4607 y Q4617 en producción 3HP (n = 3 muestras biológicas independientes). No se detectó lactato en el cultivo Q4617. Crecimiento celular y producción de 3HP (f), concentración intracelular de AcP (g) y nivel relativo de ARNm de xfspk y pta (h) de la cepa Q4617 durante una fermentación aeróbica discontinua en un biorreactor de 5 litros. Se obtuvieron resultados similares de dos muestras biológicas independientes y se mostró un resultado representativo. Producción de MVA (i) y PHB (j) utilizando cepas con diversas estrategias regulatorias en cultivo en matraz con agitación (n = 3 muestras biológicas independientes). La línea discontinua representa el rendimiento teórico nativo. Barra de error, media ± DE. Se realizaron pruebas t de Student de dos colas para determinar la significación estadística. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

El 3HP se clasificó entre los 12 productos químicos con mayor valor agregado de la biomasa39 y se produce a partir de acetil-CoA mediante la acetil-CoA carboxilasa ACC y la malonil-CoA reductasa MCR40. MCR cataliza la reducción en dos pasos de malonil-CoA a 3HP, y sus fragmentos N y C-terminales son funcionalmente distintos y muestran actividad de alcohol deshidrogenasa y aldehído deshidrogenasa, respectivamente. Además, la expresión segmentaria de MCR condujo a una mayor actividad enzimática general y mejoró la producción de 3HP7,41. Así que aquí se utilizaron los genes disecados mcr-n y mcr-c. Bajo el modelo de control estático, los genes xfspk, pta, accABCD, mcr-n y mcr-c se expresaron constitutivamente cuando fue necesario en E. coli BW25113, Q3952 y Q4531 de tipo salvaje. Las cepas con modelo de cambio dinámico expresaron el gen xfspk de manera constitutiva y la transcripción de otros genes fue activada por los sensores AcP AI y AV. Por el contrario, estos genes fueron sometidos a activación o represión dinámica automática utilizando los osciladores I-IV en otras cepas (Figura complementaria 21). En el cultivo en matraz con agitación, la integración de SCTPK y osciladores ralentizó ligeramente el crecimiento y redujo la densidad celular final (Fig. 7c), mientras que mejoró significativamente la producción y el rendimiento de 3HP (Fig. 7d). La cepa Q4607 (BW25113 que lleva la vía 3HP) acumuló 0,93 g/L de 3HP con un rendimiento de 0,09 g/g de glucosa después de 72 h de cultivo, la eliminación de genes en la cepa Q4634 (Q3952 que lleva la vía 3HP) mejoró ligeramente la producción de 3HP, mientras que La integración de SCTPK aumentó el título de 3HP y el rendimiento a 1,75 g/l y 0,23 g/g de glucosa, respectivamente. A continuación, el interruptor dinámico y los osciladores dependientes de AcP mejoraron aún más la bioproducción de 3HP. Finalmente, la cepa Q4617 que alberga SCTPK y el oscilador IV presentó el título de 3HP más alto de 7,60 g/l y un rendimiento de 0,71 g/g de glucosa, ambos más de 8 veces superiores a los de la cepa Q4607 original (Fig. 7d). Mientras tanto, la cepa Q4607 acumuló una cantidad considerable de acetato y lactato, 4,67 g/L y 3,07 g/L respectivamente, y sólo se detectaron 0,33 g/L de acetato en el cultivo de la cepa Q4617 (Fig. 7e), probablemente debido a la disminución de la concentración intracelular. nivel de piruvato. Este resultado sugirió que la SCTPK y el oscilador mejoraron la economía de los átomos de carbono durante la fermentación 3HP de dos maneras: mejorando el rendimiento de acetil-CoA a partir de glucosa e inhibiendo la síntesis de subproductos.

Además, la fermentación discontinua se llevó a cabo en un biorreactor de 5 L utilizando la cepa Q4617. Durante la fermentación, la transcripción de pta y xfspk fluctuó periódicamente en respuesta a la concentración de AcP intracelular (Fig. 7g, h), lo que sugiere que nuestro sistema oscilador tiene una gran robustez incluso en cultivos a mayor escala y es capaz de detectar AcP y regular la expresión de metabolismo. genes de forma precisa y persistente. También se determinó que la relación de aireación jugó un papel importante en la producción de 3HP (Figura complementaria 22). En condiciones optimizadas, nuestra cepa recombinante Q4617 produjo 73,42 g/l de 3HP con un rendimiento de 0,51 g/g de glucosa después de 108 h de fermentación (Fig. 7f). Hasta donde sabemos, esta es la producción más alta de 3HP reportada a través de la vía del malonil-CoA en microbios modificados.

MVA es un valioso precursor para la biosíntesis de terpenoides y PHB es un termoplástico biodegradable y biocompatible. Posteriormente, los genes sintéticos de MVA y PHB se ensamblaron en cepas recombinantes de E. coli con tres modelos de regulación diferentes, respectivamente (Fig. 23 y 24 complementarias), y se realizó la fermentación en un matraz con agitación y un biorreactor de 5 L (Fig. 7i, j y figuras complementarias 25 y 26). Al igual que con 3HP, la reconfiguración del metabolismo central a SCTPK aumentó la producción de MVA de 0,78 g/L a 1,25 g/L y la producción de PHB de 0,42 g/L a 1,00 g/L, y los rendimientos de MVA y PHB a partir de glucosa aumentaron en 1,29 y 1,06 veces, respectivamente. Cuando se ensamblaron el interruptor dinámico y los osciladores dependientes de AcP, se mejoró aún más la bioproducción de MVA y PHB. La cepa Q4624 presentó el mayor título de MVA, 4,67 g/L que fue 5,99 veces superior al de la cepa original Q4618, y el rendimiento de MVA fue de 0,61 g/g de glucosa, alcanzando el 95% del rendimiento teórico de MVA utilizando SCTPK (0,64 g/g) y excediendo su rendimiento teórico nativo (0,54 g/g). La mejor cepa para la producción de PHB fue Q4632 que acumuló 3,31 g/L de PHB, y su eficiencia de conversión de glucosa a PHB alcanzó 0,41 g/g, alcanzando el 85% y el 71% de su rendimiento teórico nativo (0,48 g/g) y teórico. rendimiento usando SCTPK (0,58 g/g) respectivamente. Además, la excreción de subproductos acetato y lactato se suprimió durante la fermentación de MVA y PHB (Figuras complementarias 25c, d). Todos estos resultados demostraron que hemos desarrollado una plataforma universal de E. coli para producir productos químicos y materiales derivados de acetil-CoA con una alta economía de átomos de carbono.

En este estudio, se construyó una maquinaria sintética universal con alta economía de átomos de carbono. En primer lugar, la vía de conservación de carbono SCTPK, que convierte la glucosa en cantidades estequiométricas de AcP sin pérdida de carbono, se estableció basándose en la introducción de fosfocetolasa trifuncional y SBPasa (Fig. 1). En segundo lugar, se desarrollaron sistemas oscilatorios utilizando circuitos genéticos con diversas propiedades de respuesta al AcP, manteniendo la homeostasis intracelular del AcP y equilibrando los recursos celulares entre el crecimiento celular y la síntesis de sustancias químicas objetivo. Finalmente, la biosíntesis de varias sustancias químicas se llevó a cabo utilizando esta maquinaria sintética, lo que representa una producción y un rendimiento mucho mayores de cada producto en comparación con el metabolismo central natural de E. coli o los modos de regulación del flujo, incluido el control estático y el interruptor dinámico de uso común. Nuestros resultados demuestran que la combinación de la construcción de una vía de conservación de carbono y la regulación oscilatoria dinámica en respuesta a un metabolito clave proporciona una estrategia atractiva para mejorar el rendimiento de las fábricas de células microbianas.

Para los microorganismos heterótrofos, el rendimiento de carbono es uno de los parámetros más importantes para evaluar su desempeño en la biofabricación industrial42. Un sistema de bioproducción típico pierde más del 30% de carbono durante el proceso de producción. Hay dos enfoques principales para elevar el límite superior del rendimiento de carbono. Una es emplear reacciones de carboxilación para fijar CO2, como la vía biosintética del succinato en la que el succinato se deriva de acetil-CoA con dos reacciones de fijación de CO243, pero esto sólo funciona con vías metabólicas específicas. El otro enfoque es evitar la descarboxilación, como lo hace el NOG al evitar la descarboxilación del piruvato para generar eventualmente acetil-CoA12, una piedra angular de una variedad de metabolitos que incluyen lípidos, alcanos y polímeros.

Aquí, se demostró que otra vía de conservación de carbono, SCTPK, es eficiente y manipulable en E. coli. Este ciclo trifuncional dependiente de fosfocetolasa se construyó y optimizó de manera integral utilizando la estrategia pull-push-promote. Específicamente, las reacciones irreversibles catalizadas por Xfspk y SBPase proporcionan fuerza impulsora e impulsan el flujo de carbono hacia este ciclo de conservación de carbono (Fig. 2a). En segundo lugar, la expresión del gen xfspk que codifica la enzima limitante de la velocidad se fortaleció colocando este gen en un plásmido con un número de copias alto, para promover la síntesis de AcP a partir de S7P, F6P y X5P. En tercer lugar, se eliminaron genes implicados en la producción de acetato, lactato, etanol y formiato para eliminar la pérdida de carbono como forma de atraer el carbono subproducto hacia la vía objetivo, y se reprimió la expresión de las proteínas PfkA, GapA y GapB que pueden desviar la SCTPK. jerárquicamente mediante matrices de ARNas combinacionales para mejorar aún más la función de SCTPK (Figs. 2a y 3a). Esta estrategia de ingeniería ha logrado excelentes resultados: la cepa resultante Q4531 presentó una concentración intracelular de AcP de 5,73 mM/OD, 2,83 veces mayor que la de la cepa de tipo salvaje E. coli BW25113 (Fig. 3f), y la tasa máxima de liberación de CO2 de La cepa Q4531 solo representó menos de un tercio de la cepa BW25113 (Fig. 3h). Cuando se combina con la vía biosintética de MVA y el oscilador sensible a AcP, el rendimiento de MVA a partir de glucosa alcanzó 0,61 g/g, superando el rendimiento teórico de MVA nativo de 0,54 g/g (Fig. 7i). Todos estos resultados demostraron que SCTPK mejoró la economía de los átomos de carbono durante el proceso de bioconversión y podría adoptarse como una nueva plataforma de secuestro de carbono para producir sustancias químicas más críticas o de valor agregado.

Sin embargo, todavía hay un problema, es decir, la SCTPK por sí sola no genera ATP ni poder reductor (Fig. 2a), que son necesarios para el crecimiento celular y la producción de sustancias químicas como 3HP, MVA y PHB. En nuestras cepas, las vías nativas de E. coli para el catabolismo de la glucosa, incluida la glucólisis, la vía de Entner-Doudoroff y la sección superior residual de la vía de las pentosas de fosfato, todavía son funcionales y pueden producir energía y equivalentes reductores. Además, las células pueden generar ATP y NAD(P)H a través del ciclo del TCA y la respiración. Por lo tanto, creemos que el ATP y el poder reductor necesarios para el crecimiento celular y la biosíntesis son suministrados por vías nativas de E. coli, y la función principal de SCTPK es producir AcP a partir de glucosa sin liberación de CO2 para mejorar la producción y el rendimiento de derivados de acetil-CoA. productos químicos. Esta situación es similar a la cepa recombinante que porta NOG informada anteriormente44. Actualmente se están estableciendo varias rutas híbridas mediante la sobreexpresión simultánea de NOG y el metabolismo central basal45,46,47. Básicamente, estas estrategias reponen energía con átomos de carbono, y esta práctica de costura da como resultado un rendimiento teórico de carbono del 61,1-83,3%48. Ahora la energía eléctrica se puede producir de manera sostenible y se puede utilizar para suministrar energía y equivalente reductor en un sistema de electrosíntesis microbiana49. Se cree que la aplicación de la generación eléctrica de ATP y la reducción del equivalente en tensiones de plataformas de conservación de carbono es una solución eficaz.

En este estudio, diseñamos y construimos varios sistemas osciladores que responden espontáneamente a AcP. Detectan el equilibrio entre dos grupos de metabolitos interconvertidos (AcP y acetil-CoA) producidos por dos enzimas Xfspk y Pta, cuyas expresiones están reguladas negativa y positivamente por AcP, respectivamente (Fig. 5). En comparación con los sensores AcP dependientes de NRI construidos previamente22,23, nuestros circuitos genéticos se optimizaron ajustando la afinidad del activador NRI o el represor PhlF a los promotores correspondientes, lo que dio como resultado sistemas osciladores más diversos con mayor duración que tienen una amplia gama de aplicaciones en biosíntesis. de diversos productos químicos y materiales. Por ejemplo, las producciones más altas de MVA y PHB se lograron con el uso del Oscilador III, mientras que 3HP con el Oscilador IV (Fig. 7d, i, j). En las cepas que portaban osciladores sostenidos, se observaron fluctuaciones periódicas de la concentración intracelular de AcP y del nivel de expresión génica tanto en el cultivo en matraz con agitación como en la fermentación por lotes alimentados (Figs. 6g, i y 7g, h), lo que sugiere una gran robustez del proceso y escalabilidad de estas oscilaciones. sistemas. Las redes metabólicas de los microbios están altamente reguladas y responden a las condiciones ambientales. Esta adaptabilidad puede beneficiar la supervivencia y el crecimiento celular, mientras que a menudo causa un rendimiento de fermentación inconsistente y perjudica la síntesis del producto en un proceso industrial, lo que resulta en dificultades en el desarrollo y escalamiento del proceso50. Se cree que estos sistemas de oscilación, que hacen que los procesos biológicos sean más predecibles y repetibles, tienen potencial para simplificar la optimización y ampliación de la bioproducción de otras sustancias químicas valiosas.

La regulación oscilatoria del flujo de carbono mejoró significativamente la producción y el rendimiento de los productos químicos y materiales objetivo en nuestro estudio. En ingeniería metabólica, existen varias estrategias para modular el flujo metabólico. Por ejemplo, los medios de regulación estática son fáciles de operar y tienen ciclos cortos, tales como sobreexpresión y eliminación de genes, modificaciones de sitios RBS y optimización del número de copias de plásmidos. Sin embargo, estos enfoques suelen traer problemas como la acumulación de metabolitos intermedios y el desperdicio de fuentes de carbono9,51. El cambio dinámico alivia el efecto de la introducción de vías exógenas sobre la distribución desigual de los recursos dentro de la célula. Sin embargo, cuando hay una acumulación o consumo excesivo de un componente o compuesto intracelular clave, se afectaría el metabolismo global de la célula9,51,52. Aquí, el modelo oscilatorio basado en una detección sofisticada del metabolito clave AcP, el producto inmediato de SCTPK y precursor de acetil-CoA y biosíntesis, proporciona una alternativa frente al problema anterior. Nuestros osciladores pueden equilibrar el flujo de las rutas de producción y consumo de AcP de forma autónoma, mantener la homeostasis intracelular de AcP (Fig. 6g y 7g) y evitar la acetilación excesiva de proteínas (Fig. 6h), lo que resulta en un aumento del rendimiento de carbono en la bioproducción. En comparación con las cepas de E. coli con una red de metabolismo central reconfigurada estáticamente, la utilización de los osciladores centrados en AcP mejoró las producciones de 3HP, MVA y PHB en 4,3, 3,7 y 3,3 veces, respectivamente, en el cultivo en matraz con agitación (Fig. 7d, yo, j). En la fermentación por lotes alimentados, se acumuló 3HP hasta 73,42 g/l con un rendimiento de 0,51 g/g de glucosa (Fig. 7f), lo que representa la mayor producción y rendimiento de 3HP informados a través de la vía de malonil-CoA.

Todos los plásmidos y cepas utilizados en este estudio se enumeran en los Datos complementarios 2 y 3, respectivamente. Los cebadores y las secuencias de partes genéticas utilizadas en este estudio se enumeran en los Datos complementarios 4 y 5, respectivamente. Se utilizó la cepa DH5α de E. coli para la construcción del plásmido. Se utilizaron E. coli BL21(DE3) y el plásmido pET28a para la sobreexpresión de FbaA, Xfspk y SBPasas de seis cepas diferentes, que se utilizaron además para la purificación de proteínas. Se utilizó E. coli BW25113 como anfitrión para la construcción, optimización y aplicación de SCTPK. Se utilizaron dos plásmidos construidos artificialmente basados ​​en pETDuet-1 y pRSFDuet-1 para expresar enzimas relacionadas en la ruta de síntesis del producto. Específicamente, se usó pETD para la expresión combinatoria de Xfspk y matrices de ARNas, mientras que pRSF se usó para la expresión combinatoria de PTA y enzimas aguas abajo de la ruta específica (MvaE y MvaS para mevalonato53; AccADBC, MCR-N y MCR-C para 3HP7; PhaC, PhaA y PhaB para PHB54; secuencias que se muestran en Datos complementarios 6). Todas las construcciones utilizadas para el desarrollo y la aplicación de herramientas se generaron mediante clonación de restricción estándar con enzimas de Takara Bio (Dalian, China) o el procedimiento del kit de clonación ClonExpress MultiS One Step de Vazyme Biotech (Nanjing, China). Se utilizaron kits de miniprep y purificación por PCR (Omega, EE. UU.) para la extracción de ADN siguiendo los protocolos del fabricante. Las células competentes se prepararon con el kit Ultra-Competent Cell Preps (Sangon Biotech, China). Los cebadores se adquirieron en un servicio de síntesis comercial (Tsingke, China). Todos los plásmidos construidos fueron confirmados mediante secuenciación de ADN (Tsingke, China).

Para la construcción de SCTPK, se utilizó la estrategia CRISPR/Cas9 basada en piedra, papel y tijera para editar el cromosoma, incluida la eliminación o el reemplazo de secuencias genéticas de genes en E. coli55. Los genes idhA, adhE, pflB, poxB, aceE, tktAB, talAB fueron eliminados. Los genes para codificar SBPasas de diferentes cepas (Bacillus metanolicus, Saccharomyces cerevisiae CEN.PK, Serratia marcescens, Synechocystis PCC 6803, Thermosynechococcus elongatus) y Xfspk de Bifidobacterium longum NCC2705 se sintetizaron con optimización de codones para E. coli (Datos complementarios 7) por BGI Biotecnología y GenScript Biotech Corporation. La SBPasa de Synechocystis PCC 6803 se integró en el genoma con un promotor constitutivo Pj23119 y B0034 RBS mediante CRISPR/Cas9. Todos los espaciadores fueron diseñados por sgRNAcas9 V3.056. Se utilizaron las siguientes concentraciones de antibióticos: espectinomicina 100 µg/mL, apramicina 100 µg/mL, cloranfenicol 33 µg/mL y tetraciclina 17 µg/mL, kanamicina 50 µg/mL y ampicilina 100 µg/mL. Para silenciar los genes pfkA, gapA y gapB, se seleccionaron diferentes promotores (Pj23116, Pj23118, Pj23119) y longitudes de secuencia objetivo (0, 50, 80, 100, 150, 200 nt) para verificar el efecto de la represión de asRNA. Las matrices de asRNA se ensamblan a través de Golden Gate. El promotor glnAp2 mutado que contiene diferentes potenciadores o reguladores se produjo mediante mutagénesis de plásmido dirigida al sitio en un solo paso. Brevemente, se generó mutagénesis mediante PCR inversa del plásmido utilizando los cebadores correspondientes, y el producto de la PCR digerido por DpnI (New England Biolabs, EE. UU.) se transformó en E. coli DH5α. Las colonias con mutaciones relacionadas se verificaron mediante PCR y se confirmaron mediante secuenciación de ADN. Para construir un circuito de retroalimentación negativa, se introdujo en el genoma el represor PhlF inducido por el promotor Pg junto con un RBS B0031 débil mediante CRISPR/Cas9.

Se utilizó medio Luria-Bertani (LB) para la construcción de plásmidos y cepas. Para probar si SCTPK es funcional in vivo, se utilizaron medio LB y medio mínimo M9 modificado, que contiene 15,11 g/L Na2HPO4·12H2O, 3,0 g/L KH2PO4, 1,0 g/L NH4Cl, 0,5 g/L NaCl, 20 g/L. L de glucosa, 1 g/L de extracto de levadura, CaCl2 0,1 mM, MgSO4 1 mM, FeCl3 0,1 mM y 10 ml de solución de oligoelementos (0,18 g/L ZnSO4·7H2O, 0,12 g/L MnSO4·H2O, 0,18 g/L CoCl2·6H2O, 0,12 g/l CuCl2·2H2O).

Para la producción de MVA y PHB, el medio de fermentación contiene 9,8 g/L de K2HPO4·3H2O, 2,1 g/L de citrato hidrato, 0,3 g/L de citrato férrico de amonio, 0,25 g/L de MgSO4·7H2O, 5 g/L de extracto de carne, 2 % glucosa y 1 mL de solución de oligoelementos (0,29 g/L ZnSO4·7H2O, 0,37 g/L (NH4)6Mo7O24·4H2O, 0,25 g/L CuSO4·5H2O, 1,58 g/L MnCl2·4H2O y 2,47 g/L H3BO4 ). Para la producción de 3HP, el medio mínimo modificado contiene 14 g/L de K2HPO4·3H2O, 5,2 g/L de KH2PO4, 1 g/L de NaCl, 1 g/L de NH4Cl, 0,25 g/L de MgSO4·7H2O, 5 g/L de extracto de levadura. y 2% de glucosa. Los experimentos en matraces con agitación se llevaron a cabo por triplicado en matraces de 250 ml que contenían 50 ml de medio. Para excluir el efecto del extracto de carne o del extracto de levadura en la producción de las sustancias químicas objetivo, se realizaron experimentos de control utilizando el medio anterior sin glucosa. La producción de 3HP, MVA y PHB fue inferior a 80 mg/L (Figura complementaria 27), lo que indica que el extracto de carne o el extracto de levadura solo tuvieron un efecto estimulante del crecimiento, pero no pueden usarse para producir sustancias químicas objetivo. Entonces, el rendimiento del producto químico objetivo se calculó mediante la siguiente ecuación:

La fermentación se llevó a cabo en un biorreactor de 5 L que contenía 2 L de medio. La temperatura del cultivo se controló a 37 °C, el pH se mantuvo en 7,0, el oxígeno disuelto (OD) se mantuvo por encima del 40% de saturación mediante agitación en cascada (400 a 700 rpm) y no se necesitó ningún inductor químico. Después de que las fuentes iniciales de carbono estuvieron casi agotadas, se inició el modo de alimentación por lotes alimentando una solución que contenía 50% (p/v) de glucosa. Se tomaron muestras según fue necesario y se analizaron.

El crecimiento celular se analizó midiendo la densidad óptica (DO) del cultivo a 600 nm usando un espectrofotómetro (U-2900; Hitachi). La concentración de glucosa residual se detectó mediante un analizador de detección biológica SBA-40ES (Instituto de Biología, Academia de Ciencias de Shandong, China). El piruvato, acetato, lactato, MVA y 3HP se determinaron utilizando un sistema HPLC serie Agilent 1260 Infinity equipado con una columna HPX-87H (Bio-Rad, Hercules, CA) (300 × 7,8 mm) a 40 °C con 5 mmol/L. ácido sulfúrico como fase móvil. Todas las muestras de cultivo se centrifugaron a 12.000 × g durante 10 minutos y luego se filtraron a través de un filtro de 0,22 μm antes del análisis.

Para determinar el contenido de AcP, se cultivaron colonias individuales que albergaban los plásmidos correspondientes durante la noche en medio LB a 37 °C. Luego, las células se lavaron, se resuspendieron en medio M9 nuevo que contenía glucosa al 2 % con una DO600 inicial de 0,02 y se cultivaron a 37 °C con agitación. Al alcanzar la fase estacionaria, las células se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS, 10 mM, pH 7,2–7,4) y se rompieron utilizando un disruptor celular de alta presión (Constant Systems LTD, Reino Unido). El ensayo AcP se derivó de un estudio previo con modificaciones menores12,47. Específicamente, se agregaron 500 µl de muestra a 250 µL de reactivo de hidroxilamina (clorhidrato de hidroxilamina 4 M: hidróxido de sodio 3,5 M = 1:1, v/v) y se mantuvieron a temperatura ambiente durante 10 minutos para formar hidroxamato. Luego se añadió el reactivo colorante, 750 μL de solución de cloruro férrico (cloruro férrico al 5%: ácido tricloroacético al 12%: HCl 3 M = 1:1:1, v/v/v), y se mantuvo a temperatura ambiente durante 5 minutos, y la absorbancia a 540 nm se midió usando un lector de microplacas (Spark, Tecan). El PHB se midió utilizando métodos previamente informados con ligeras modificaciones57. Brevemente, las células se separaron del caldo de fermentación mediante centrifugación a 12.000 x g y 4 ° C durante 10 min. Los sedimentos celulares se lavaron dos veces con agua destilada y se liofilizaron, se trataron con veinte mililitros de una solución de NaOH 0,05 M durante 3 horas y luego se centrifugaron a 15.000 xg durante 20 minutos. El sedimento se lavó dos veces con etanol enfriado con hielo (95 %, calidad analítica) y se sometió a liofilización para su posterior análisis.

Para detectar la liberación de CO2, se utilizó un sistema de análisis de gases (BCP-CO2, BlueSens, Alemania) para registrar y analizar in situ los cambios en tiempo real de CO2 en el matraz agitado durante la incubación. Los cultivos se cultivaron a 37 °C con agitación a 180 rpm. El detector monitorea el volumen de CO2 cada 1 minuto y transmite la información a una computadora.

Las células de E. coli se recogieron y se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS, 0,01 M, pH 7,2–7,4) y se rompieron utilizando un disruptor celular de alta presión (Constant Systems LTD, Reino Unido). La proteína recombinante marcada con his6 se purificó utilizando la columna Ni-NTA His·Bind (Novagen). La proteína se cuantificó utilizando un kit de ensayo de proteínas Bradford (Beyotime, China), se fraccionó en un gel SDS-PAGE al 12 % y se visualizó mediante tinción con azul de Coomassie. Para la transferencia Western, las proteínas se transfirieron a una membrana de PVDF (Millipore) y se bloquearon utilizando un reactivo Western de bloqueo rápido (Beyotime, China). Se utilizó el anticuerpo HRP Anti-6X His tag [GT359] (Abcam, n.º de catálogo ab184607, 1:10 000) para detectar proteínas marcadas con His6 y un anticuerpo monoclonal de ratón con acetil lisina (EasyBio, China, n.º de catálogo BE3411, 1:2000). ) y anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón (H&L) conjugado con HRP (EasyBio, China, número de catálogo BE0102, 1:10,000) se utilizó para el análisis de acetilación de proteínas. Luego, la señal de la proteína se detectó utilizando el sustrato Immobilon Western HRP (Millipore) y el sistema de imágenes Fusion FX6 (Vilber, Francia).

La proteína purificada se desalinizó utilizando una columna NAP-10 (GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, EE. UU.). La actividad de SBP/FBPasa se determinó de la siguiente manera58: la mezcla de reacción que contenía Tris/HCl 50 mM, pH 8,0, MgCl2 15 mM, DTT 10 mM, E4P 10 mM, DHAP 10 mM y FbaA y SBP/FBPasa purificadas se incubó a 37 °C. durante 30 min y la reacción se detuvo mediante la adición de ácido perclórico 0,2 M. Luego las muestras se centrifugaron y el sobrenadante se sometió a cuantificación de fosfato. Se incubaron alícuotas (20 µL) de la muestra y estándares (KH2PO4 0-0,5 mM) con 340 µL de solución de molibdato (molibdato de amonio al 0,3% en H2SO4 0,55 M) durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se añadieron sesenta microlitros de solución de verde de malaquita (0,035 % de verde de malaquita, 0,35 % de alcohol polivinílico) y las muestras se incubaron durante 45 minutos más. La absorbancia a 620 nm se determinó utilizando un lector de microplacas multimodo (Spark, Tecan). La reacción catalizada por fosfocetolasa tuvo lugar durante 30 min en un tampón que contenía Tris/HCl 50 mM (pH 8,0), MgCl2 15 mM, DTT 10 mM, KCl 5 mM, fosfato potásico 20 mM, pirofosfato de tiamina 1 mM, fosfocetolasa 0,25 μM y 10 sustrato mM. Para la actividad fosfocetolasa S7P, se complementaron DHAP y E4P 10 mM con FbaA y SBPasa 0,25 μM. Para la actividad fosfocetolasa F6P y X5P, se utilizaron F6P y X5P 10 mM, respectivamente. La reacción se detuvo añadiendo 25 µL de reactivo de hidroxilamina. Posteriormente, se midió la concentración de AcP.

Para analizar el crecimiento celular y la intensidad de la fluorescencia, los datos correspondientes se registraron en un lector de microplacas multimodo (Spark, Tecan) utilizando placas negras de 96 pocillos. La intensidad de mTagBFP2 se midió a una longitud de onda de excitación (EX) de 402 ± 5 nm y una longitud de onda de emisión (EM) de 457 ± 10 nm, la intensidad de GFP se midió a una EX de 480 ± 5 nm y una EM de 520 ± 10 nm, y la intensidad de mCherry se midió a una EX de 588 ± 10 nm y una EM de 645 ± 10 nm. Se midieron la fluorescencia de fondo de la cepa sin expresión de proteínas fluorescentes (FLbg) y la DO de fondo del medio (ODbg), y las intensidades de fluorescencia relativas se calcularon mediante la siguiente ecuación:

Para la microscopía de fluorescencia, se utilizó el microscopio confocal de barrido láser LSM900 (ZEISS, Alemania) y se utilizó Fiji (NIH) para fusionar las imágenes de los canales. Para detectar patrones espaciales, se extendió la cepa Q4602 sobre una placa de agar LB, se colocó un disco de papel de filtro esterilizado en el centro de la placa y se administró solución de AcP al disco. Después de crecer durante la noche a 37 °C, la fluorescencia se visualizó utilizando un transiluminador LED (BL-20, LABGIC).

El ARN total se aisló utilizando el kit de ARN bacteriano EASYSpin Plus (Aidlab Biotechnologies, China) y se midió utilizando un espectrofotómetro Nanodrop oneC (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). Se eliminó el ADN genómico y se obtuvo el ADNc utilizando el kit Evo M-MLV RT con gDNA Clean para qPRC II (Accurate Biology, China). La PCR cuantitativa se realizó utilizando el kit SYBR Green Pro Taq HS qPCR (Accurate Biology, China) con el sistema QuantStudio 1 (Applied Biosystems). El gen rpoD transcrito constitutivamente se utilizó como control de referencia para normalizar la cantidad total de ARN de diferentes muestras. La cantidad relativa del nivel de ARNm se calculó utilizando el método 2-ΔΔCt. Se realizaron tres muestras biológicas independientes con dos repeticiones técnicas para cada muestra.

El software para el procesamiento de datos inicial fue Microsoft Excel 2019, y los análisis y trazados posteriores se llevaron a cabo utilizando OriginPro 2022 (OriginLab) y Graphpad Prism 9 (Graphpad). Los espaciadores de gRNA fueron diseñados por sgRNAcas9 v3.0. Las intensidades de fluorescencia se determinaron utilizando magellan 3.0 (Tecan). Los datos de imágenes fueron obtenidos y procesados ​​por Zen 3.3 (Zeiss) y Fiji (NIH). Las curvas relevantes se ajustaron utilizando OriginPro 2022 (OriginLab). Se utilizó el modelo logístico para calcular la tasa de crecimiento específica. Se realizaron pruebas t de Student de dos colas para determinar la significación estadística.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

La siguiente información se proporcionó en archivos de datos complementarios: los plásmidos utilizados en este estudio (Datos complementarios 2), cepas (Datos complementarios 3), cebadores (Datos complementarios 4), las secuencias de promotores, gobernadores, potenciadores, terminadores, péptidos enlazadores y genes utilizados en los circuitos genéticos de detección de AcP y la biosíntesis (Datos complementarios 5 y 6), secuencias y números de acceso de SBPasas (Datos complementarios 7). Los datos originales se proporcionan con este documento.

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Este estudio fue apoyado financieramente por el Programa Nacional Clave de Investigación y Desarrollo de China (2022YFC2104700 y 2021YFC2100500 a GZ), NSFC (22277068 a ML, 32170085 a GZ), los Fondos de Investigación Fundamental para las Universidades Centrales (2021JCG025 a GZ), el Programa de Académicos Distinguidos de la Universidad de Shandong (GZ) y la Fundación para Grupos de Investigación Innovadores del Laboratorio Estatal Clave de Tecnología Microbiana (WZCX2021-02).

Estos autores contribuyeron igualmente: Likun Guo, Min Liu.

Laboratorio Estatal Clave de Tecnología Microbiana, Universidad de Shandong, Qingdao, 266237, China

Likun Guo, Min Liu, Yujia Bi, Qingsheng Qi y Guang Zhao

CAS Key Lab of Biobased Materials, Instituto de Tecnología de Bioenergía y Bioprocesos de Qingdao, Academia de Ciencias de China, Qingdao, 266101, China

Mo Xian y Guang Zhao

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GZ y LG diseñaron los experimentos. LG, ML e YB realizaron los experimentos. GZ, LG, ML, QQ y MX analizaron los resultados. GZ, LG y ML escribieron el manuscrito. Todos los autores editaron el manuscrito antes de enviarlo.

Correspondencia a Guang Zhao.

Este trabajo ha sido incluido en las solicitudes de patente chinas de la Universidad de Shandong (solicitud n.º 2023107236122 y 2023107489681). Los coautores de la patente incluyen a GZ, LG, ML, YB y Jichao Wang. La patente cubre la construcción y optimización de la vía de conservación de carbono SCTPK, el diseño y caracterización de circuitos genéticos para la activación e inhibición del acetilfosfato, el establecimiento de un sistema oscilatorio central para el acetilfosfato y la aplicación del sistema oscilatorio del acetilfosfato en la biosíntesis de productos químicos y materiales. Otros autores no afirman tener intereses en competencia.

Nature Communications agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Un archivo de revisión por pares está disponible.

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Reimpresiones y permisos

Guo, L., Liu, M., Bi, Y. et al. Utilizar maquinaria sintética para mejorar el rendimiento de carbono con acetilfosfato como núcleo. Nat Comuna 14, 5286 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-41135-7

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Recibido: 15 de mayo de 2023

Aceptado: 23 de agosto de 2023

Publicado: 30 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-41135-7

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